花青素是植物中广泛存在的一种水溶性色素，属于类黄酮化合物。花青素的存在使许多植物的组织呈现紫色或者红色等。“紫鹃”是从云南大叶种中选育出来的一个紫色叶片茶树品种，它的花青素含量大约是国内已知的其他紫色叶片茶树品种的三倍。在本研究中，作者以3年生的茶树幼苗为材料，利用比较转录组策略对“紫鹃”的花青素代谢分子机制进行了分析。

        首先作者对“紫鹃”萌发的芽（S1）、萌发后7天的叶片（S2）、萌发后15天的叶片（S3）、萌发后40天的叶片共4个阶段的组织进行取样。对这4个阶段的叶片组织花青素含量检测表明S3阶段花青素积累最多；然后进一步检测了S3阶段花青素的主要构成，发现矢车菊素-3-O-半乳糖苷（峰5）和飞燕草色素-3-O-半乳糖苷（峰8）是“紫鹃”叶片中主要的花青素成分。

        对“紫鹃”上述4个阶段组织样品和“英红9号”（从云南大叶种选育的另一个品种）的S2阶段叶片分别进行转录组测序。对涉及色素积累的三个主要次生代谢途径（类黄酮合成途径、花青素合成途径、黄酮和黄酮醇合成途径）相关基因的表达情况进行了分析，共鉴定到308个相关基因；对花青素合成途径的结构基因表达情况分析发现在早期合成阶段的相关基因没有明显差异表达，但是后期合成基因 CsF3′H, CsF3′5′H, CsDFR1, CsDFR2, CsLDOX1, CsLDOX2 and CsLDOX3 showed 12.7-, 6.49-, 2.3-, 10.7-, 36.4-, 37.9- and 7.9-fold higher levels of expression, respectively, in purple-colored foliage than in the corresponding green-colored foliage；另外CsLAR1、CsLAR2和CsLAR3编码儿茶素合成酶类基因显著高表达。表明花青素的积累受相关基因表达的调控。此外，根据前期在其他物种中的研究结果，MYB-bHLH-WDR (MBW) 转录因子复合体调控类黄酮的合成， In particular, a subgroup of R2R3-MYB characterized by the presence of the bHLH interacting signature ([DE]Lx2[RK]x3Lx-6Lx3R) in the R2R3 domain and a C-terminus KPRPR[S/T]F motif that is typical of anthocyanin regulators has been well documented in the literature。鉴于此，作者又对花青素合成相关的MYB、bHLH、WD40转录因子差异表达基因进行了分析，鉴定到了两个基因并分别命名为CsAN1和CsAN2，并且这两个基因与拟南芥AtMYB113转录因子基因同源（在拟南芥中该基因调控花青素合成），此外在S2阶段，这两个基因中只有CsAN1在紫叶组织中显著上调表达（19.4倍）；We also investigated anthocyanin biosynthesis-related bHLH TFs and WD-repeat genes in the C. sinensis leaf transcriptome. Two homologues of AtGL3 and AtEGL3 (CsGL3 and CsEGL3) and a homologue of AtTTG1 (CsTTG1) were identifed. 但是只有CsGL3又1.7倍的上调表达，而CsEGL3和CsTTG1在“紫鹃”和“英红9”中没有明显差异表达。综合以上结果，作者将CsAN1作为“紫鹃”中调控花青素积累的候选基因。

        接着对CsAN1进行了功能分析。首先亚细胞定位显示CsAN1位于细胞核，转录活性分析表明其活性区域位于C端195-254残基。

而MYB转录因子能够特异结合MBS位点，而CsLDOX1和CsLDOX2的启动子区域含有MBS位点，酵母单杂交实验表明CsAN1能够结合CsLDOX1和CsLDOX2的启动子，表明CsLDOX1和CsLDOX2的表达受CsAN1调控。酵母双杂交和双分子荧光互补表明CsAN1 和 CsTTG1 都能够与 CsGL3 和 CsEGL3互作，但是CsAN1 和 CsTTG1不互作，CsAN1 和 CsTTG1能与bHLH形成MYB/bHLH/WD 复合体。进一步的，双重荧光素酶分析表明CsAN1、CsTTG1和CsGL3复合体共同激活CsLDOX2的启动子。For MBW-induced anthocyanin pigment accumulation in N. benthamiana, CsAN1, CsAN1/CsGL3, CsAN1/CsEGL3, CsAN1/CsGL3/CsTTG1 and CsAN1/CsEGL3/CsTTG1 were syringe-infltrated into the underside of expanding tobacco leaves. 结果表明 CsAN1/CsGL3/CsTTG1能够显著提高花青素积累。

To investigate the molecular basis of the higher expression levels of CsAN1 in the purple foliage of tea, the promoter of CsAN1 was isolated from ‘ZJ’, ‘RHBH’, ‘FY6’ and ‘YH9’. 序列分析发现CsAN1基因的启动子区域在4个茶树品种中存在SSR变异，并且都包含 I 类长末端重复逆转录转座子原件，而这些原件可能会通过表观变化激活或者抑制靶基因的表达，因此作者对不同品种中CsAN1基因启动子的胞嘧啶甲基化水平进行了分析，结果表明低甲基化能够促进CsAN1基因的表达。

最后作者研究了光照和温度对MBW复合体以及花青素合成相关基因的表达影响，结果表明低温和长光照促进花青素积累可能是由于该条件下MBW复合体基因的激活表达引起的。此外在低温和长光照下诱导了CsAN1基因启动子的脱甲基化。

Sun B, Zhu Z, Cao P, et al. Purple foliage coloration in tea (Camellia sinensis L.) arises from activation of the R2R3-MYB transcription factor CsAN1. Sci Rep, 2016, 6:32534.